疏水層析（HIC）亦稱為疏水作用層析，是利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離的層析技術。

 

    從作用機制來看，它屬于吸附層析。非極性化合物例如苯、環己烷在水中的溶解度非常小，與水混合時會形成互不相溶的兩相，即非極性分子有離開水相進入非極性相的趨勢，即所謂的疏水性(Hydrophobicity)。非極性溶質與水溶劑的相互作用則稱為疏水效應(Hydrophobiceffect)。

 

    疏水效應疏水作用(hydrophobicinteraction):非極性分子進入水中，有聚集在一起形成小疏水面積的趨勢，保持這些非極性分子聚集在一起的作用則稱為疏水作用。對于可溶蛋白，溶劑是水，疏水側鏈因此被包埋在蛋白質內部。終的結構是適合周圍溶液的熱動力學折衷的結果。就球形蛋白質的結構而言，其分子中的疏水性殘基數是從外向內逐步增加的。雖然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白內部，有些則暴露在外，在蛋白質表面形成疏疏水和親水部件表面的溶菌酶。疏水部分是深紅色,淺紅色的更少的疏水性。親水部分顯示在深藍色的,更少的親水部分是淺藍色。水區域，這部分暴露在外疏水性基團稱為疏水補丁。

 

二、疏水層析原理

 

   高度規則的水殼層包圍在配基和蛋白的疏水表面周圍。疏水物質被迫融合以減少這種殼的總面積（熵大）。在純水中，任何疏水效應都太弱而不能導致配基和蛋白之間或蛋白自身的相互作用。鹽能夠增強疏水作用。

 

   親水性強的蛋白質與疏水性固定相結合作用原理

 

①靠蛋白質表面的一些疏水補丁(hydrophobicpatch)；

②令蛋白質發生局部變性(可逆變性較理想)，暴露出掩藏于分子內的疏水性殘基；

③高鹽作用。疏水層析的特性所致，即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水性殘基才能與疏水性固定相作用。

 

   一般在lmol／L(NH4)2SO4或2mol／LNaCl高濃度鹽溶液中，親水性較強的組分物質，會發生局部可逆性變性，并能被迫與疏水的固定相結合在一起。然后通過降低流動相的離子強度，即可將結合于固定相的物質，按其結合能力大小，依次進行解吸附。

 

    也就是：疏水作用弱(即親水性強)的物質，用高濃度鹽溶液洗脫時，會先被洗下來。當鹽溶液濃度降低時，疏水作用強的物質才會隨后被洗下來。（相同鹽濃度下，疏水作用弱的物質先被洗下來，疏水作用強的物質隨后被洗下來）。

 

    對于疏水性很強的物質，則需要在流動相添加適量有機溶劑降低極性才能達到解吸附的目的。

 

三、疏水層析介質

 

    疏水層析介質由基質和配體(疏水性基團)兩部分構成。基質主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，瓊脂糖類凝膠仍是應用廣泛的疏水介質。HIC介質的疏水配基主要為烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。


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